構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)，一旦引物設(shè)計(jì)好，那接下來(lái)就非常簡(jiǎn)單了，今天重點(diǎn)就來(lái)教教大家如何利用 snapgene 輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列。

1. 打開軟件，選擇第一個(gè)（紅線標(biāo)記），然后輸入基因的 CCDS 序列（基因的 CCDS 序列可在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得）。

2.點(diǎn)擊 ok 后界面，圖中顯示的是會(huì)切割基因編碼序列的酶

3. 接下來(lái)點(diǎn)擊最上面的 Enzymes Noncutters，會(huì)顯示所有不會(huì)切割基因編碼序列的酶，這些酶都是我們可以用的，選酶的標(biāo)準(zhǔn)：要選擇不能切割目的基因序列并且質(zhì)粒上含有的酶，還有就是最好是實(shí)驗(yàn)室有的酶。

4. 確定了可以用的酶后，接下來(lái)需要確定設(shè)計(jì)引物時(shí)用的這兩種酶，確定方法：這兩種酶最好不要鄰近，最好使用雙酶切有共同 buffer 的酶,兩個(gè)酶切位點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來(lái)的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。

5. 確定了所要用的酶之后，接下來(lái)需要做的就是設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)（注意：一定要看清楚載體上 promoter 的方向，將 CDS 正向插入到 promoter 后面）。

6. 點(diǎn)擊左下角的 sequence，然后拉取上游一部分基因本身的序列，拉取的時(shí)候會(huì)顯示拉取的堿基的個(gè)數(shù)以及 Tm 值，拉取到 Tm 值 55 度左右就可以（55 度以上最好）。

7. 然后點(diǎn)擊 primer——add primer，選擇 top strand。

8. 點(diǎn)擊 insertions，在 site 位置處選擇你準(zhǔn)備引入的酶，比如我要引入 EcoR I，那我就選擇它，然后點(diǎn)擊 insert，這樣我們就引入了該酶的酶切位點(diǎn)。

9. 接下來(lái)需要添加保護(hù)堿基，所有的酶的保護(hù)堿基都加三個(gè)，哪個(gè)堿基沒(méi)有要求,使 GC 含量及 Tm 值適中即可。

10. 這樣上游引物就設(shè)計(jì)好了，接下來(lái)需要檢測(cè)一下引物是否會(huì)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，可以應(yīng)用OligoCalc，如果發(fā)現(xiàn)會(huì)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，那就需要對(duì)引物序列做出一些調(diào)整，直到發(fā)卡結(jié)構(gòu)消失。

11. 接下來(lái)拉取基因的下游的一部分序列，用同樣的方法設(shè)計(jì)好下游引物，有一點(diǎn)需要注意的是，設(shè)計(jì)下游引物的時(shí)候選擇 bottom strand。

這樣構(gòu)建載體所需的引物就設(shè)計(jì)好了，怎么樣，是不是感覺(jué)其實(shí)也沒(méi)有那么難，接下來(lái)就可以構(gòu)建屬于你自己的載體了。

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